Тема 2.2. Анализ биологических образцов методом пламенной фотометрии

Пламенно-фотометрический (эмиссионный) метод используется в аналитической практике не более четырех десятилетий, несмотря на то, что впервые был предложен именно для этих целей Бупзеном и Кирхгофом в середине XIX века. Он основан на измерении интенсивности излучения возбуждаемых в пламени атомов. Дальнейшим развитием пламенно-фотометрического метода стал атомно-абсорбционный анализ. Этот метод, основанный на поглощении характеристического излучения невозбужденными атомами, был предложен в 1955 г. австралийским ученым А. Уолшем, разработавшим оригинальный источник монохроматического света - лампу с полым катодом.

В почвенно-агрохимических исследованиях пламенно-фотометрический метод применяется главным образом для определения натрия, калия и кальция в золе растений и почвенных вытяжках. Пламенно-фотометрический метод отличается как доступностью оборудования и простотой его эксплуатации, так и высокой производительностью.

В настоящее время атомно-абсорбционный метод используется для анализа более 70 элементов. Он стал основным аналитическим методом в металлургии и геохимии, однако в почвенно-агрохимических исследованиях применяется главным образом для анализа микроэлементов и не получил пока столь широкого распространения, как пламенно-фотометрический, вследствие сложного оборудования и трудностей эксплуатации.

ПРИНЦИП МЕТОДА

При распылении в пламени раствора, содержащего соли металлов, растворитель испаряется, а соли распадаются на атомы и простые молекулы. При определенной температуре пламени атомы возбуждаются. По прошествии ~ Ю-7 с возбужденный электрон возвращается в основное состояние, излучая свет с характеристическим спектром.

Интенсивность света 1т, излучаемого при переходе электрона с уровня m на основной уровень, выражается формулой

Im = BN0cxp(-Em/kT),

где В - константа, iVo - число невозбужденных атомов, Ет - энергия возбужденного уровня, к - постоянная Больцмапа, Т - абсолютная температура.

Повышение температуры приводит к экспоненциальному росту интенсивности излучения за счет увеличения числа возбужденных атомов, хотя оно невелико: составляет менее 1% от общего числа атомов определяемого элемента в пламени. Интенсивность излучения /т возбужденных атомов анализируемого элемента связана с концентрацией С элемента в пробе зависимостью

Im = аС,

где а - постоянная величина при данных условиях испарения пробы и возбуждения атомов.

В атомно-абсорбциопном методе термическая энергия пламени также используется на испарение растворителя и разложение соединений на атомы. Но в отличие от метода пламенной фотометрии, здесь представляют интерес атомы, находящиеся в пламени в основном (невозбужденном) состоянии. Они способны поглощать (абсорбировать) характеристическое излучение, эмиссируемое дополнительным источником при возбуждении в нем атомов анализируемого элемента.

В процессе абсорбции электрон переходит с основного энергетического уровня на более высокий. При этом интенсивность возбуждающего света данной частоты понижается. Здесь, как и в молекулярной абсорбционной спектроскопии, действует закон Ламберта- Бугера-Бера:

Л = Lg(Io/I) = КЪС,

где А — величина, характеризующая уровень поглощения света (абсорбция), Iq — начальная интенсивность проходящего света, К — коэффициент поглощения, 6 —толщина поглощающего слоя, С — концентрация определяемого элемента.

Из этой формулы следует, что зависимость между поглощением света и концентрацией элемента линейна. В свою очередь, поглощение света зависит от заселенности основного уровня: увеличение любым путем числа атомов в пламени приводит к увеличению чувствительности определения как пламенно-фотометрическим, так и атомно-абсорбционным методами. Однако увеличение числа атомов в возбужденном состоянии за счет атомов, находящихся в основном состоянии, приведет к увеличению чувствительности эмиссионного метода и к уменьшению чувствительности абсорбционного. Чувствительность метода пламенной фотометрии.

Oбычно определяется как концентрация элемента в растворе, соответствующая повышению на 1% интенсивности излучения линии этого элемента над фоновым излучением пламени и пробы. Пламенно-фотометрический метод используется главным образом в случае анализа щелочных и щелочноземельных элементов, для возбуждения которых не требуется очень высокой температуры пламени. При сгорании газовых смесей, применяемых для этих целей, температура пламени достигает следующих значений: пропан- воздух - 1950 °С; водород-воздух - 2100 и ацетилен- воздух - 2400 °С.

При анализе элементов атомно-абсорбционным методом температура пламени имеет меньшее значение, чем в пламенно-фотометрическом. Наибольшее распространение в этом способе получило пламя ацетилен- воздух благодаря высокой пропускной способности в области спектра с X > 200 им и очень слабой собственной эмиссии. Кроме того, окислительно-восстановительные свойства пламени ацетилен-воздух можно регулировать в широких пределах — от сильно окислительного (с большим излишком воздуха) до сильно восстановительного (с большим излишком ацетилена). Это пламя обеспечивает высокую эффективность атомизации более чем 30 элементов.

Вторым по важности для атомно-абсорбционного метода является пламя С2Н9 N2O. Его использование позволяет определить почти все элементы таблицы Менделеева. Для аналитических целей в абсорбционном анализе используется только восстановительное пламя С2Н2- N2O. Большинство элементов атомизируется в красной зоне внутреннего .конуса пламени, которая своим цветом обязана эмиссии циановых радикалов в области 650 нм. Пламя С2Н2- N2O имеет температуру около 2950 °С, при высокой пропускаемо- сти во всем спектре: от 190 до 850 нм. Аналитические возможности пламени ацетилен-воздух и C2H2-N2O взаимно дополняют друг друга.

Метод пламенной фотометрии применяется, в основном, для определения щелочных и щелочноземельных элементов. Для определения калия, натрия и кальция можно использовать низкотемпературное пламя пропан-воздух. Определение остальных щелочных и щелочноземельных элементов, характеризующихся более высокой энергий возбуждения, возможно при использовании высокотемпературных пламен.

Недостатком пламенно-фотометрического метода является значительное наложение друг на друга соседних линий спектра, принадлежащих разным химическим элементам, приводящее к влиянию на концентрацию определяемого элемента других элементов, находящихся в анализируемом растворе. Следствием этого является не всегда достаточная точность и селективность анализа. Особенно это наложение сказывается при использовании пламенных фотометров со светофильтрами, не обеспечивающими эффективного выделения спектральных линий определяемого элемента. Кроме того, при работе на пламенных фотометрах для определения щелочных элементов обычно используют низкотемпературное пламя пропан-воздух, в котором условия возбуждения атомов анализируемых элементов сильно зависят от состава анализируемого раствора (матричный эффект).

По этим причинам в настоящее время пламенные фотометры постепенно выходят из употребления, а определение щелочных металлов проводят, например, на атомно- абсорбционных спектрофотометрах, которые могут работать в эмиссионном режиме. При этом из-за более совершенной оптики и возможности использования высокотемпературного пламени точность и воспроизводимость результатов анализа существенно повышается. Однако пламенные фотометры выпуска прежних лет продолжают интенсивно использоваться в химическом анализе почв. Пламенно-фотометрический метод по-прежнему является наиболее удобным и часто применяемым в химическом анализе почв методом определения содержания натрия и калия. Устройство пламенного фотометра и правила работы на нем.

Для анализа используют пламенные фотометры, состоящие из горелки с распылителем, монохроматора (как правило, светофильтров), регистрирующей системы (фотоумножитель, усилитель, индикатор) . В почвенно-химических исследованиях наиболее широкое распространение получили отечественные пламенные фотометры ПФМ (рисунок)

и приборы фирмы «Carl Zeiss» Флафо-4. Атомно- абсорбционные спектрофотометры, работающие в режиме измерения эмиссии, имеют такую же принципиальную схему, как и обычные пламенные фотометры , но в качестве монохроматоров используются дифракционные решетки. Фотоэлектрический пламенный фотометр ПФМ предназначен для пламенно-фотометрического количественного определения щелочных и щелочноземельных элементов в пламени пропан-воздух иди ацетилен-воздух. Перед проведением измерений необходимо следующее:

1. Включить прибор в сеть и дать ему прогреться в течение времени, указанного в руководстве по эксплуатации.

2. Включить компрессор и рукояткой вентиля «Воздух» установить по манометру давление воздуха в пределах 0,2-0,4 атм (20-40 кПа).

3. Перед подачей газа (пропана или ацетилена) в горелку необходимо проверить исправность зажигания - при нажатии кнопки «Зажигание» через смотровое окно наблюдают проскакивание искры.

4. Для подачи газа открывают вентиль на баллоне с газом, а затемвентилем фотометра «Газ» плавно увеличивают подачу горючего газа, контролируя его давление по манометру. Рабочее давление пропана должно составлять 40-80 мм, а давление ацетилена- 100-200 мм водного столба. Если давление газа достигает указанной величины, нажимают на кнопку «Поджиг пламени» до воспламенения горючей смеси.

5. Регулируя подачу газа и воздуха, добиваются устойчивого горения пламени. При этом внешний конус пламени должен быть светло-голубым и иметь резкие контуры. Выбранный режим работы горелки (давление газа и воздуха) записывают в журнал и при повторном включении прибора устанавливают такое же давление.

6. В зависимости от особенностей используемого прибора, в оптическую систему вводят светофильтр, соответствующий определяемому элементу или настраивают монохроматор на нужную длину волны.

7. Определение концентраций исследуемых элементов следует начинать с построения калибровочного графика для каждого элемента по стандартным растворам известной концентрации. Для того чтобы снизить мешающее влияние состава раствора на определение концентрации, состав стандартных растворов должен быть максимально приближен к составу анализируемого раствора. Это правило справедливо для всех методов атомной спектрофотометрии, но для фотометрии пламени его нужно соблюдать особенно строго из-за недостаточной селективности метода.

Построение калибровочной кривой совмещают с настройкой усилителя аналитического сигнала, от которого зависит чувствительность определения и соотношение сигнал/шум. Для этого, распыляя в пламя горелки дистиллированную воду, ручкой установки нуля стрелку индикаторного прибора приводят к 0. После этого распыляют стандартный раствор с концентрацией, немного превышающей предполагаемую максимальную концентрацию элемента в анализируемых растворах. Пользуясь ручками грубой и точной настройки усиления, добиваются отклонения стрелки индикаторного прибора приблизительно на 80-90% шкалы. После этого вновь распыляют в пламя дистиллированную воду и корректируют положение нуля.

Не рекомендуется при определении низких концентраций элементов пользоваться стандартными растворами с высокими их концентрациями. Не допускается работать в области концентраций, превышающей самый концентрированный стандартный раствор. Это приводит к существенному снижению точности определений. Когда чувствительность прибора отрегулирована, производят определение концентрации элемента во всей шкале стандартных растворов, начиная с наименьшей концентрации. Отсчеты показаний индикаторного прибора берут после того, как они стабилизируются. При сильных колебаниях стрелки прибора обычно берут среднее значение.

После снятия шкалы стандартных растворов промывают распылитель дистиллированной водой, распыляя ее в пламя, а затем приступают к определению концентрации элемента в анализируемых растворах. После работы с каждой пробой обязательно промывают распылитель, контролируя возвращение на 0 стрелки индикаторного прибора. Калибровочный график строят либо на миллиметровой бумаге, откладывая по оси абсцисс концентрацию, а по оси ординат показания прибора, либо производят расчет уравнения регрессии на компьютере. В последнем случае удобно работать с нелинейными калибровочными кривыми. По графику или уравнению находят концентрации элемента в анализируемых растворах.

При определении концентрации элементов пламенной. фотометрией наибольшее применение нашел метод градуировочного графика. Он состоит в измерении в одних и тех же условиях интенсивности излучения определяемого элемента в серии стандартных растворов и в растворе исследуемого образца. По результатам фото- метрирования стандартных растворов строят градуировочиый график, откладывая но оси абсцисс концентрацию раствора (мкг/мл), а по оси ординат-показания гальванометра. Используя полученный график, находят концентрацию элемента в исследуемом растворе. При изготовлении стандартных растворов следует выбрать рабочую область концентраций. Верхняя граница области определяется возможностью самопоглощения излучения в пламени, что приводит к изгибу градуировочной прямой к оси абсцисс. Нижняя граница области определяется максимальной чувствительностью, которая может быть достигнута для определяемого элемента на данном фотометре. Для построения градуировочного графика обычно готовят серию растворов с концентрациями элементов от 5 до 60 мкг/мл. Другим приемом определения содержания элементов является метод добавок. Он основан на измерении интенсивности излучения анализируемого раствора и этого же раствора с добавкой известного количества определяемого элемента. Искомую концентрацию С можно найти по формуле

С = С1До/(Д1-До),

где До и Д1 — показания прибора для раствора пробы без добавки и с добавкой; С\ —концентрация добавки (мкг/мл). Метод добавок применяется в тех случаях, когда необходимо создать одинаковые условия фотометрирования элемента в растворе, содержащем мешающие соединения (катионы, анионы или органические растворители).

Фотометрия пламенная, один из видов эмиссионного спектрального анализа. Применяется главным образом для количественного определения в растворах атомов многих металлов и редкоземельных элементов по их спектральным линиям или полосам. Источником возбуждения спектров является пламя светильного газа, водорода, ацетилена или дициана. Анализируемый раствор инжектируется в пламя в виде аэрозоля в токе кислорода или воздуха. Наиболее распространено водород-кислородное пламя, характеризующееся достаточно высокой температурой (2900 К), малой интенсивностью собственного излучения и отсутствием в пламени твёрдых частиц при неполном сгорании.

Определяемое излучение выделяется узкополосным фильтром или монохроматором, в котором в качестве диспергирующего элемента применяется призма или дифракционная решётка. Благодаря сравнительной простоте спектров пламени и высокой стабильности излучения пламени измерение интенсивностей спектральных линий производится почти исключительно фотоэлектрическим способом. Приёмником излучения служит фотоэлемент или фотоэлектронный умножитель, а регистрирующим прибором – гальванометр или самописец. Регистрация спектральных линий или полос на самописце обычно проводится методом сканирования, полученная запись выражает зависимость интенсивности излучения от длины волны. Мерой концентрации исследуемого элемента служит интенсивность его спектральной линии. Зависимость интенсивности линий от концентрации устанавливается по результатам фотометрирования спектров эталонных растворов. Преимущества Ф. п. – точность, скорость и высокая чувствительность (для щелочных элементов 0,01 мкг/мл, для щёлочноземельных – 0,1 мкг/мл). Дляанализа по методу Ф. п. применяют спектрофотометры с автоматической регистрацией спектров и выдачей результатов.

Применение фотометрии

Фотометрический метод анализа на сегодняшний день является одним из наиболее распространенных инструментальных методов. Плюсами фотометрии являются его высокая точность, возможность работать с малыми количествами веществ и относительно небольшое время, затрачиваемое на анализ. Область применения фотометрического анализа очень широка и включает в себя анализы, проводимые в промышленных, учебных, научно-исследовательских, фармацевтических, химико-технологических, экологических, клинико-диагностических медицинских, биохимических и других лабораториях.

Фармакология – определение подлинности и состава готовых лекарственных препаратов и сырья для их изготовления:

Экстракт элеутерококка

Лейкопластырь бактерицидный

Сульфадиметоксин

Фурацилин

Ацетилсалициловая кислота (аспирин)

Рибоксин

Анестезин

Глюконат кальция

Дибазол

Альфаглюкомин

Амфотерицин В

Витамин В12

Клинические анализы: Определение в крови и желчи иода, билирубина, холестерина, гемоглобина в крови.

Экология – определение показателей качества атмосферного воздуха:

Диоксид азота NO2

Монооксид азота NO

Диоксид серы SO2

Карбоновые кислоты R-COOH

Марганец Mn

Метанол CH3-OH

Свинец и его соединения Pb

Сероводород H2S

Серная кислота H2SO4

Сульфаты SO42-

Сумма азотной кислоты и нитратов HNO3 + NO3-

Фенол C6H5-OH

Фосфорный ангидрид Р2О5

Формальдегид CH2O

Фосфаты РО43-

Фосфорная кислота H3PO4

Фтористый водород HF

Хлор Cl2

Хлористый водород HCl

Хром (VI) Cr6+

Цианиды CN -

Охрана здоровья – определение показателей качества воздуха рабочей зоны:

Едкие щелочи

Серная кислота H2SO4

Диоксид серы SO2

Диоксид азота NO2

Диоксид кремния SiO2

Формальдегид CH2O

Свинец и его соединения Pb

Хлористый водород HCl

Фтористый водород HF

Цианистый водород HCN

Озон O3

Стирол С6Н5- СН= СН2

Оксид хрома (VI) CrO3

Оксид хрома (III) Cr2O3

Аммиак NH3

Молибден Mo

Аэрозоль масла

Титан Ti

Марганец Mn

Оксид железа (III) Fe2O3

Сероводород H2S

Сероуглерод СS2

Анионный поверхностно-активные вещества

Уксусная кислота СН3-СООН

Сумма одноосновных карбоновых кислот R-COOH

Алюминий и его соединения Al

Ванадий и его соединения V

Вольфрам и его соединения W

Кобальт и его соединения Co

Медь и ее соединения Cu

Водорастворимые соединения никеля Ni

Цинк и его соединения Zn

Пары ртути Hg

Метанол CH3-OH

Хлор Cl2

Определение показателей качества промышленных выбросов:

Аммиак NH3

Аэрозоль масла

Оксиды азота NOх

Диоксид серы SO2

Фенол С6Н5-ОН

Фтористый водород HF

Акролеин H2C=CH-CHO

Едкие щелочи

Серная кислота H2SO4

Формальдегид CH2O

Твердые фториды F

Контроль качества питьевой воды:

Металлы: алюминий Al, марганец Mn, медь Cu, молибден Mo, никель Ni, цинк Zn, свинец Pb, серебро Ag

Синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ)

Мышьяк As

Нитраты NO3

Цветность

Мутность

Полиакриламид

Полифосфат

Фенолы

Флокулянты

Определение показателей качества природных, очищенных сточных и сточных вод:

Металлы: алюминий Al, железо Fe, кадмий Cd, кобальт Co, висмут Bi, марганец Mn, медь Cu, молибден Mo, натрий Na, калий К, никель Ni, олово Sn, свинец Pb, хром Cr, цинк Zn

Неметаллы: мышьяк As, кремний Si

Азот общий и органический, аммонийная, нитритная и нитратная формы азота, аммиак

Бораты

Катионные и анионные поверхностно-активные вещества (ПАВы)

Ксантогенаты

Летучие фенолы

Метанол СН3-ОН

Фосфор общий, органический, фосфаты

Сероводород Н2S и сульфиды S2-

Формальдегид СН2О

Химическое потребление кислорода (ХПК)

Цветность

Цианиды CN-

Контроль содержания химических веществ в почве:

Алюминий Al, марганец Mn, магний Mg, нитраты NO3 -, аммоний NH4+

органические вещества CxHy.

Контроль качества продуктов питания:

Методом фотометрии определяется качество мяса, мяса птицы, колбасы, масла, консервов, фруктов, овощей, продуктов переработки плодов и овощей, кетчупа, горчицы, майонезов, соусов, безалкогольных напитков, соков, пива, спиртов, ликероводочных изделий, вина, коньяков, и коньячных спиртов, кофепродуктов, кондитерских изделий, желатина и других продуктов питания.

Например, в них определяют:

нитриты натрия в колбасных изделиях, в плодоовощной продукции

остаточную активность кислой фосфатазы в колбасных изделиях

общий фосфор в мясе и мясных продуктах

сорбиновую кислоту в продуктах переработки плодов и овощей

бензойную кислоту в продуктах переработки плодов и овощей

массовую долю кофеина в кофе и кофепродуктах

в пищевых продуктах и сырье железо, мышьяк, олово

цветность пива

высшие спирты в коньячных спиртах

Возможность проведения экспресс-метода определения содержания сорбиновой и бензойной кислот при их совместном присутствии по ультрафиолетовым спектрам позволяет ускорить время анализа и упростить пробоподготовку.

В данном разделе приведен довольно внушительный, но все же неполный список областей, в которых применяется спектрофотометрия. На самом же деле он гораздо более широкий.

Контрольные вопросы

Контрольные вопросы

1. Сформулируйте основной закон светопоглощения;
2. Какую величину измеряет спектрофометр?
3. Что такое «молярный коэффициент светопоглощения»? Что он характеризует?
4. Как правильно подобрать кювету для фотометрических определений?
5. Перечислите основные методы фотометрии. Что у них общего и чем они различаются?
6. В чем заключается суть спектрофотометрических определений?
7. От каких факторов зависит оптическая плотность растворов?
8. Как правильно подобрать длину волны света для фотометрических определений?
9. В чем измеряется длина волны света?
10. Какие правила следует соблюдать при пользовании фотометрическими кюветами?
11. Как называется величина, обратная оптической плотности?
12. Перечислите важнейшие детали спектрофотометра;
13. Что такое «монохроматор»? Каковы его функции?
14. Перечислите области применения фотометрического анализа;
15. Используя градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации нитритов в растворе определить содержание нитритов (мг/л) в пробе с оптической плотностью 0,1